為 ELISA 試劑盒制備細胞或組織裂解物

與 RayBio ® ELISA 試劑盒一起使用的細胞或組織裂解液可以使用大多數(shù)常規(guī)方法來制備，例如在RayBio® 裂解緩沖液中勻漿細胞或組織。您還可以使用自己的裂解緩沖液，例如 RIPA 或其他針對免疫沉淀優(yōu)化的配方。

請注意以下有關裂解緩沖液成分的指南：

1. 避免使用 >0.1% SDS 或其他強變性洗滌劑。一般來說，非離子型去污劑（如 Triton X-100 或 NP-40）是好的，但兩性離子型去污劑（如 CHAPS）或溫和的離子型去污劑（如脫氧膽酸鈉）也可以。

2. 總洗滌劑用量不超過 2% v/v

3. 避免使用疊氮hua鈉

4. 避免使用 >10 mM 還原劑，例如二硫蘇糖醇或巰基乙醇

我們強烈建議在均質化之前向裂解緩沖液中添加蛋白酶抑制劑混合物。大多數(shù)通用生化供應公司（包括 Roche、Sigma-Aldrich、Pierce 和 Calbiochem）都備有多種此類產品。由于對蛋白水解的敏感性和裂解液中存在的蛋白酶類型各不相同，因此我們不推薦特定的產品。相反，您選擇使用哪種蛋白酶抑制劑組合應基于對您感興趣的蛋白質和/或組織或細胞類型的文獻檢索?？梢允褂昧姿崦敢种苿皇潜匦璧?，除非試劑盒中使用的抗體特異性識別蛋白質的磷酸化形式。

裂解和勻漿方法的選擇包括玻璃珠“粉碎"、粉碎、凍融、超聲處理和用研缽和杵粉碎冷凍組織，甚至這些方法的組合。沒有適用于所有樣本類型的最佳方法；您應該在簡要搜索文獻后選擇方法，以了解在以前的調查中如何準備與您相似的樣本。

均質化后，離心裂解物以去除細胞/組織碎片（5 分鐘 @ 10,000 xg 或 10 分鐘 @ 5,000 xg）并保存上清液。除非新鮮測試，否則裂解物應盡快冷凍并儲存在 -20°C（或 -80°C，如果可能）下。在進行任何免疫測定孵育之前再次離心。接下來，使用不受去垢劑抑制的總蛋白測定（例如二辛可寧酸 (BCA) 測定）確定裂解物的蛋白質濃度，并標準化每個樣品的體積，以便為每個測定提供相同量的總蛋白。

注意：不建議使用 Bradford 測定法，因為它可能會因洗滌劑的存在而受到抑制。

由于不同的細胞和組織可能含有不同量的蛋白質，作為起點，我們建議每 1x10 6 個細胞或 10 mg 組織使用 500 µL 裂解緩沖液。您可能需要根據(jù)您的結果進行調整。勻漿的目標總蛋白濃度應至少為 1,000 µg/mL，但 2,000 µg/mL 或更高會更好。

無論您擁有哪種樣品類型，強烈建議您在制備后對所有樣品進行分裝，以大程度地減少多次凍融循環(huán)造成的蛋白質降解。這也確保了進一步實驗的樣品的可用性。