冷凍干燥是將需要干燥的藥液預(yù)先冷凍成固體的干燥方法。并在低溫低壓條件下直接升華以除去冷凍狀態(tài)的水，而不需要經(jīng)過液態(tài)。由于整個(gè)操作過程處于低溫狀態(tài)，因此該方法特別適用于熱敏性蛋白藥物制劑的制備。凍干后的蛋白藥物呈松散狀，不僅有利于保存，而且有利于蛋白藥物復(fù)溶后的復(fù)性。

顯然，凍干技術(shù)為理化性質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)藥物的制備提供了有效的方法。然而，凍干過程是一個(gè)復(fù)雜的相變過程。藥物在冷凍、凍融、干燥、儲(chǔ)存過程中引起蛋白質(zhì)變性的因素有很多。因此往往需要使用一些保護(hù)劑來穩(wěn)定處方中的蛋白質(zhì)。冷凍保護(hù)劑種類繁多，作用機(jī)制也復(fù)雜。本文將對(duì)蛋白質(zhì)凍干產(chǎn)品的保護(hù)劑進(jìn)行綜述。

在凍干制品的整個(gè)生產(chǎn)過程中，存在著多種應(yīng)力，包括低溫應(yīng)力、冷凍應(yīng)力、干燥應(yīng)力等。這些應(yīng)激往往是直接或間接導(dǎo)致蛋白藥物不穩(wěn)定的因素。根據(jù)抗應(yīng)激保護(hù)劑的不同，蛋白質(zhì)保護(hù)劑初步分為冷凍保護(hù)劑和凍干保護(hù)劑。優(yōu)秀的蛋白質(zhì)保護(hù)劑不僅可以在整個(gè)凍干過程中保護(hù)蛋白質(zhì)藥物，而且可以抑制蛋白質(zhì)藥物在成品儲(chǔ)存期間的變性。由于蛋白質(zhì)藥物在儲(chǔ)存過程中的變性速率往往大于冷凍干燥過程中的變性速率，大多數(shù)在溶液中有效的蛋白質(zhì)冷凍保護(hù)劑對(duì)干燥蛋白質(zhì)沒有保護(hù)作用，甚至?xí)铀俚鞍踪|(zhì)藥物的不穩(wěn)定比例。

為了擴(kuò)大保護(hù)作用，需要在凍干產(chǎn)品中使用兩種以上的保護(hù)劑，如多羥基化合物、糖、蛋白質(zhì)、聚合物、氨基酸、鹽、胺、表面活性劑等。

1.多羥基化合物

多羥基化合物長期以來被用作蛋白質(zhì)的防凍劑。常見的凍干保護(hù)劑有甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇、硫醇、聚乙二醇等。甘油可以促進(jìn)凍干*酶的復(fù)性。而當(dāng)甘油濃度升至0.8%時(shí)，*酶即可全復(fù)性。在某些處方中，甘露醇可以作為蛋白質(zhì)的凍干保護(hù)劑。甘露醇對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用與其濃度、形態(tài)、結(jié)構(gòu)有關(guān)，其濃度有時(shí)與晶體形態(tài)有關(guān)。一般認(rèn)為，無定形甘露醇具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用，而結(jié)晶甘露醇則失去保護(hù)功能。1%或更低濃度的甘露醇通過形成無定形結(jié)構(gòu)阻止蛋白質(zhì)藥物的聚集，但高濃度的甘露醇容易形成結(jié)晶態(tài)促進(jìn)蛋白質(zhì)藥物的聚集。

2.糖

糖是最常見和廣泛使用的凍干保護(hù)劑類型。它是蛋白質(zhì)的非特異性穩(wěn)定劑，在凍干的各個(gè)階段都能對(duì)蛋白質(zhì)藥物起到一定的保護(hù)作用。糖的保護(hù)作用與其類型有關(guān)，蛋白質(zhì)和雙糖是研究最多也有效的保護(hù)劑，其中蔗糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖組成的二糖，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)無定形。對(duì)于阻斷蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，冷凍干燥過程和延長儲(chǔ)存期間蛋白質(zhì)的延伸和聚集發(fā)揮著重要作用。

與蔗糖相比，海藻糖的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度較高，吸濕性較低，無還原性。這些優(yōu)點(diǎn)都表明海藻糖可能具有更廣闊的應(yīng)用前景。與小分子糖相比，大分子糖似乎對(duì)蛋白質(zhì)提供的保護(hù)較少。許多研究表明，高分子量的多糖并不是凍干保護(hù)劑的選擇。

但一些研究卻顯示出相反的結(jié)果，如大分子量菊粉研究表明，聚合度為5.5-6.0的菊粉對(duì)堿性磷酸酶的保護(hù)作用明顯高于海藻糖和低聚合度的菊粉。這說明多糖的保護(hù)作用不能一概而論。

特別是在儲(chǔ)存期間，右旋糖酐或多糖可以提高產(chǎn)品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，防止蛋白質(zhì)因產(chǎn)品崩解而被破壞。葡萄糖在凍干過程中可以部分保持無定形形式，這對(duì)某些蛋白質(zhì)藥物有一定的保護(hù)作用，但需要注意的是，應(yīng)謹(jǐn)慎選擇以葡萄糖為基礎(chǔ)的還原糖作為蛋白質(zhì)保護(hù)劑。糖對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用有時(shí)取決于其濃度。

通常，糖的保護(hù)作用在一定濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，保護(hù)作用達(dá)到最大值，然后增加糖的濃度，保護(hù)作用不再明顯增加，有時(shí)反而會(huì)降低。關(guān)于糖發(fā)揮最大保護(hù)作用時(shí)的濃度有不同的報(bào)道。

例如，100mmol/L蔗糖對(duì)B-半乳糖酶具有最佳保護(hù)作用，而對(duì)磷酸果糖激酶提供最大保護(hù)作用的海藻糖濃度為300mg/ml。已報(bào)道的可實(shí)現(xiàn)最大穩(wěn)定的低糖濃度是足夠的在蛋白質(zhì)表面形成單分子層。

事實(shí)上，糖對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用不僅取決于糖的總體濃度，還取決于兩者的比例。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)α-D-吡喃甘露糖、乳糖、海藻糖、纖維二糖與重組人生長激素的摩爾比為131:1時(shí)，它們都能100%占據(jù)重組人生長激素上的強(qiáng)水結(jié)合位點(diǎn)和弱水結(jié)合位點(diǎn)，提供最佳保護(hù)效果。當(dāng)摩爾比達(dá)到300:1和1000:1時(shí)，糖對(duì)重組人生長激素的保護(hù)作用不再增加，并且在某些處方中保護(hù)作用會(huì)降低。

糖的還原特性和其他特性也會(huì)影響其對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用。葡萄糖、乳糖、麥芽糖、纖維二糖和其他還原糖可與蛋白質(zhì)中暴露的某些氨基酸殘基發(fā)生麥拉德反應(yīng)（氨或棕色反應(yīng)）。會(huì)使產(chǎn)品變黃并降低蛋白質(zhì)活性。不同旋光度的麥芽糖糊精在凍干過程中對(duì)乳酸脫氫酶的保護(hù)作用表現(xiàn)出很大差異。

目前用作蛋白質(zhì)保護(hù)劑的糖包括葡萄糖、α-D-吡喃甘露糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、纖維二糖、甘露糖、麥芽糖、肌醇、白糖、菊粉、葡聚糖、麥芽糖糊精、麥亞多糖、肝素、2-羥丙基-B環(huán)糊精和很快。雖然糖可以為大多數(shù)蛋白質(zhì)提供可靠的保護(hù)，但并不是所有的蛋白質(zhì)都能受到糖的保護(hù)，這仍需要更細(xì)致和深入的研究。

3.氨基酸

氨基酸是常見的蛋白質(zhì)保護(hù)劑之一。在冷凍過程中，低濃度的甘氨酸可以通過抑制10或100mmol/L磷酸緩沖鹽結(jié)晶引起的pH值變化來防止蛋白質(zhì)藥物的變性。無定形形式的甘氨酸可以防止重組人生長激素在冷凍干燥過程中聚集。結(jié)晶甘氨酸可提高成品的崩解溫度，防止崩解引起的蛋白質(zhì)藥物的破壞。常用的氨基酸蛋白保護(hù)劑有脯氨酸、色氨酸、谷氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、鹽酸賴氨酸、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等。

4.聚合物

聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、明膠、聚乙烯亞胺和其他聚合物也常用作蛋白質(zhì)的冷凍保護(hù)劑。一般來說，聚合物的穩(wěn)定效果取決于聚合物的多種性能。不同聚合度和濃度的聚合物提供不同的保護(hù)。例如，聚合度高的PVP具有較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。隨著PVP濃度和分子量的增加，水溶液的粘度會(huì)增加，蔗糖的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度會(huì)顯著升高，這也增加了冷凍過程中對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)。

但聚合度太大時(shí)，聚合物會(huì)在冷凍過程中結(jié)晶，失去對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用。過高的濃度和分子量會(huì)增加最終產(chǎn)品的水分，使產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)更加不穩(wěn)定。右旋糖酐40對(duì)豬胰蛋白酶的穩(wěn)定作用比右旋糖酐80更強(qiáng)，表明適當(dāng)?shù)木酆衔镦滈L有利于胰蛋白酶的穩(wěn)定性。

5.蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)保護(hù)劑可分為兩類：一類是蛋白質(zhì)藥物，另一類是外來蛋白質(zhì)。一些蛋白質(zhì)凍融后的活性與蛋白質(zhì)的初始濃度直接相關(guān)。初始濃度的增加有時(shí)會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)的復(fù)性。

常用的外來蛋白質(zhì)保護(hù)劑是血清白蛋白，它是一種經(jīng)典且優(yōu)異的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。例如，1%牛血清白蛋白可以防止兔肌肉乳酸脫氫酶水溶液在冷凍時(shí)失去活性。人血清白蛋白在較低濃度（0.05%-0.1%）下能有效阻止蛋白質(zhì)表面的吸附，對(duì)凍干過程中對(duì)數(shù)蛋白質(zhì)有保護(hù)作用。但由于血清白蛋白潛在的血源性病原體污染限制了其在蛋白質(zhì)產(chǎn)品中的應(yīng)用。重組人白蛋白已被推薦作為血清白蛋白的替代品。

6.其他

一些表面活性劑（Tween 80、Bridger、Pluronic、十二烷磺酸鈉）可以在冷凍機(jī)干燥過程中對(duì)蛋白質(zhì)起到一定的保護(hù)作用。在一些凍干產(chǎn)品中，添加鹽和胺可以獲得特定的蛋白質(zhì)穩(wěn)定效果。不同類型的保護(hù)劑組合可以得到穩(wěn)定性更好的凍干產(chǎn)品。

如何獲得穩(wěn)定的凍干蛋白產(chǎn)品，選擇合適的保護(hù)劑非常重要。那么如何選擇合適的防護(hù)劑呢？首先我們要對(duì)所要保護(hù)的蛋白藥物的理化性質(zhì)有充分的了解，然后通過實(shí)驗(yàn)找出導(dǎo)致蛋白藥物在凍干過程和儲(chǔ)存過程中不穩(wěn)定的因素，然后針對(duì)這些不穩(wěn)定因素選擇具體的防護(hù)劑。一般來說，糖和多羥基化合物是常用的凍干保護(hù)劑。其中，蔗糖、海藻糖等二糖對(duì)某些蛋白質(zhì)能表現(xiàn)出良好的保護(hù)作用。

優(yōu)秀的凍干保護(hù)劑應(yīng)具有多種保護(hù)性能，如高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度、低吸濕性、低結(jié)晶率、不含還原基團(tuán)等。但任何單一的保護(hù)劑不可能具備所有的保護(hù)特性，因此有時(shí)必須考慮2種或多種保護(hù)劑來穩(wěn)定蛋白質(zhì)藥物。

結(jié)論

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的蛋白質(zhì)藥物被開發(fā)出來。迄今為止，除了采用冷凍干燥技術(shù)外，還沒有更有效的制備方法來制備更穩(wěn)定的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。即使采用凍干技術(shù)制備某些蛋白質(zhì)產(chǎn)品，仍然需要一些有效的輔助方法，例如添加凍干保護(hù)劑以增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。近年來，凍干保護(hù)劑及其保護(hù)機(jī)制的研究更加深入。尤其是蛋白質(zhì)分析方法的改進(jìn)，為蛋白質(zhì)保護(hù)劑的研究提供了便利。

計(jì)算機(jī)技術(shù)在凍干過程中的應(yīng)用，使得能夠建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型來模擬和分析物料在凍干過程中的真實(shí)狀態(tài)，這也使得凍干技術(shù)得以改進(jìn)和提高。但蛋白質(zhì)穩(wěn)定機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，蛋白質(zhì)凍干產(chǎn)品的研究有待進(jìn)一步深化。開發(fā)更好的凍干保護(hù)劑和提高蛋白藥物凍干產(chǎn)品的質(zhì)量仍然是當(dāng)前生物技術(shù)藥物研究的重點(diǎn)和方向。