為了使用熒光標(biāo)記物獲得最佳結(jié)果，必須考慮幾個(gè)因素。

首先，這是激發(fā)光源：為了減少樣品自發(fā)熒光可能產(chǎn)生的干擾，激發(fā)波長(zhǎng)優(yōu)選在550 nm甚至600 nm以上。除了減少背景之外，紅色光譜范圍在處理活細(xì)胞時(shí)也具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榭梢詼p少損傷。

其次，熒光標(biāo)記應(yīng)在激發(fā)波長(zhǎng)下具有強(qiáng)吸收以及高熒光量子產(chǎn)率。消光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率的乘積通常稱為染料的“亮度"。

染料的熒光效率在光譜的藍(lán)色和綠色區(qū)域最高。在某些情況下，量子產(chǎn)率幾乎達(dá)到100%的理論極限。對(duì)于更長(zhǎng)的波長(zhǎng)，發(fā)射的量子產(chǎn)率急劇下降，尤其是在水溶液中。然而， ATTO-TEC已成功開(kāi)發(fā)出即使在 650 nm 下也具有高量子產(chǎn)率的熒光標(biāo)記。例如，ATTO 647N在水溶液中發(fā)出的熒光強(qiáng)度是舊花青染料 Cy5 ™的兩倍。ATTO 647N和 Cy5 ™的相對(duì)熒光強(qiáng)度。PBS 水溶液1 cm 池中相應(yīng)吸收最大值處的吸光度為 0.04。22 °C 時(shí)兩個(gè)吸收光譜（相同吸收）交叉處的熒光激發(fā)。

 
最后，標(biāo)記物的發(fā)射光譜應(yīng)與所用濾光片組的傳輸相匹配。反過(guò)來(lái)，必須選擇濾光片組，使其阻擋樣品散射的激發(fā)光并允許熒光盡可能有效地通過(guò)。

當(dāng)使用波長(zhǎng)為 635 nm 的二極管激光器作為激發(fā)源以及在 650 nm 至 750 nm 之間具有高透射率的濾光片組時(shí)，例如ATTO 647N將是一個(gè)非常好的選擇。從ATTO染料列表可以看出， ATTO647N635 nm處具有高消光系數(shù)，接近吸收曲線最大值的波長(zhǎng)，以及優(yōu)異的熒光量子產(chǎn)率（η fl = 65%）。

下表概述了一些常用的激勵(lì)源和推薦的ATTO標(biāo)簽。
 

熒光標(biāo)記物的特性
然而，應(yīng)該注意的是，除了已經(jīng)討論的光學(xué)考慮因素之外，選擇標(biāo)記時(shí)其他因素也很重要，例如染料的 pH 依賴性光學(xué)和化學(xué)特性、其溶解度、光和化學(xué)特性穩(wěn)定性、發(fā)色團(tuán)的大小或連接體的長(zhǎng)度等，其涉及或滿足各自應(yīng)用的要求。這些特性與染料作為熒光標(biāo)記物的適用性非常相關(guān)。

最重要的是，染料在照射過(guò)程中保持完整。許多常見(jiàn)的標(biāo)記，例如熒光素衍生物 FITC，具有非常低的光穩(wěn)定性。因此，當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間觀察過(guò)程時(shí)，使用高強(qiáng)度激光激發(fā)時(shí)成像的靈敏度和質(zhì)量會(huì)受到限制。這對(duì)于顯微鏡和其他基于共焦原理的技術(shù)（例如單細(xì)胞的檢測(cè)）來(lái)說(shuō)是一個(gè)嚴(yán)重的缺點(diǎn)。與一些常用的舊染料相比，新型ATTO標(biāo)簽的設(shè)計(jì)即使在長(zhǎng)時(shí)間暴露后也顯著更加穩(wěn)定。

ATTO 655與傳統(tǒng) Cy5的光穩(wěn)定性比較TM在水里。使用 250 W 鹵鎢燈照射，聚焦到 1 cm 池中。消光與照射持續(xù)時(shí)間。

許多常見(jiàn)的熒光標(biāo)記物即使在沒(méi)有照射的情況下（即在黑暗中）也會(huì)分解，特別是當(dāng)暴露于實(shí)驗(yàn)室大氣中的低濃度臭氧時(shí)。在相同的臭氧暴露條件下，染料ATTO 647N和ATTO 655的穩(wěn)定性比花青染料 Cy5 TM和 Alexa647 TM長(zhǎng) 100 倍。這在微陣列應(yīng)用中非常重要，因?yàn)槿玖戏肿游挥诒砻?，因此直接暴露在大氣中?/span>

緊湊而強(qiáng)大的激光二極管現(xiàn)在覆蓋了光譜的整個(gè)可見(jiàn)光和近紅外部分。它們已作為非常有效的激發(fā)源進(jìn)入許多應(yīng)用/設(shè)備，并越來(lái)越多地取代傳統(tǒng)光源。

如果沒(méi)有最大吸收與現(xiàn)有激發(fā)源的波長(zhǎng)完*對(duì)應(yīng)的標(biāo)記，則應(yīng)選擇波長(zhǎng)稍長(zhǎng)的染料。吸收會(huì)稍微降低，但激發(fā)波長(zhǎng)和熒光光譜之間的較大差異（與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)）具有在檢測(cè)過(guò)程中更好地分離散射激發(fā)光的優(yōu)點(diǎn)。