建議及技巧：

用于蛋白檢測(cè)的Duolink® PLA技術(shù)可提供一種具有一系列明確定義步驟的簡(jiǎn)易而直接的實(shí)驗(yàn)方法。該章節(jié)將會(huì)對(duì)可確保Duolink® PLA實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的一些重要注意事項(xiàng)進(jìn)行描述。

一、前期考慮：

1.采用在待測(cè)樣品內(nèi)可具有最佳一抗性能的條件。這些條件包括樣品處理參數(shù)（固定、通透化、抗原修復(fù)等）、一抗效價(jià)以及孵育時(shí)間。

2.為了可對(duì)結(jié)果進(jìn)行正確的評(píng)估，在實(shí)驗(yàn)中總是需要設(shè)置技術(shù)及可用的生物學(xué)對(duì)照。

3.Duolink® PLA Control Kit是一款可對(duì)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)并獲取成功結(jié)果的便捷工具。它包含有利 Duolink® PLA試劑進(jìn)行蛋 白間相互作用觀察的帶有預(yù)鋪板細(xì)胞的顯微玻片以及一對(duì)抗體。PLA信號(hào)是具有保障的。采用該款對(duì)照試劑盒可提升Duolink® PLA技術(shù)的可靠性或?yàn)槟膶?shí)驗(yàn)增添更多的對(duì)照。

二、常見實(shí)驗(yàn)參數(shù)：

1.永遠(yuǎn)不要讓您的樣品變干。在加濕箱中進(jìn)行孵育步驟。

2.確保去除樣品中多余的洗滌溶液。殘留的洗滌溶液會(huì)造成抗體的進(jìn)一步稀釋并降低連接或擴(kuò)增的效率。

3.可采用一支疏水筆將樣品圈出來。當(dāng)使用孔板玻片時(shí)，這將有助于防止孔間的溶液交叉污染。當(dāng)使用組織切片時(shí)，這可以將所需的試劑體積降低到低值。

4.在合適的溫度及孵育時(shí)間條件下進(jìn)行所有的步驟以獲取最佳的結(jié)果，特別是酶相關(guān)的步驟（連接及擴(kuò)增）。

5.在進(jìn)行低豐度蛋白檢測(cè)時(shí)，可能需要將擴(kuò)增時(shí)間進(jìn)行延長(zhǎng)。如果在這些條件下出現(xiàn)背景提升，可使用Duolink®Brightfield Amplification Buffer（不含有檢測(cè)寡核苷酸）獨(dú)立進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)步驟，并隨后采用Duolink®Fluorescent Amplification Buffer（含有檢測(cè)寡核苷酸）進(jìn)行一步30分鐘的孵育。

6.在大量的洗滌溶液中進(jìn)行洗滌并確保樣品被覆蓋。按要求分別使用洗滌溶液A或B。在室溫進(jìn)行洗滌。

7.在使用過程中將酶放置在冰凍模塊中。確保其他的試劑解凍（如連接溶液和擴(kuò)增溶液）并在使用前進(jìn)行渦旋混勻。

三、樣品儲(chǔ)存及分析：

1.所有的® PLA探針必須儲(chǔ)存在4 °C；包括使用Duolink® Probemaker生成的。不要凍存，否則結(jié)果將會(huì)被顯著減弱。

2.對(duì)于熒光相關(guān)的應(yīng)用，在使用帶有DAPI的Duolink® Mounting Media進(jìn)行封片后將玻片避光儲(chǔ)存在4 °C最長(zhǎng)可達(dá)4天。密封儲(chǔ)存在-20 °C最長(zhǎng)可達(dá)6個(gè)月。

3.不可過度曝光。熒光信號(hào)會(huì)發(fā)生聚結(jié)使得獲取準(zhǔn)確的定量分析結(jié)果更加困難。需要注意的時(shí)，信號(hào)聚結(jié)并不會(huì)影響流式細(xì)胞分析。

4.實(shí)驗(yàn)及對(duì)照樣品應(yīng)采用相同的捕獲參數(shù)進(jìn)行拍照成像。

四、故障排除：

盡管注意到了所有的注意事項(xiàng)，也使用一些很好的建議和技巧，結(jié)果有時(shí)也不是會(huì)符合預(yù)期。陽性對(duì)照無信號(hào)以及高背景是免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中最為常見的兩種問題，并在使用Duolink® PLA技術(shù)時(shí)也有可能會(huì)發(fā)生。下表列舉了這些常見問題的可能誘因以及建議的解決方案。