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對于 OD600測量時，穿過樣品的光被懸浮在樣品中的細胞向隨機方向散射。這種光散射是特定細胞大小和形狀以及細胞懸液密度的函數(shù)。此外，死細胞和細胞碎片可能會導致光散射。相同密度的不同細胞類型（例如每毫升細胞數(shù)）可能導致不同的 OD600值。
分光光度計的光學配置在特定儀器檢測到的光散射中起著重要作用。不同的 OD600當在具有不同光學設置的分光光度計上測量時，將報告相同細菌培養(yǎng)物的值。一個 OD600的 0.8 可以在另一臺儀器上報告為 0.5，而不會在任何一臺設備上出現(xiàn)錯誤。
DeNovix DS-11 系列分光光度計/熒光計可使用 1 μL 微量模式（適合高密度培養(yǎng)物）或各種光程比色皿模式測量微生物培養(yǎng)物。
許多研究人員依賴靶標 OD600在收獲微生物細胞培養(yǎng)物或確定接種用于蛋白質表達研究的培養(yǎng)物的正確密度時從文獻來源獲得的值。遺憾的是，這些目標值可能不適合細胞類型和所用儀器的組合。建議將 OD600使用與 OD 相關的生長曲線根據(jù)經驗確定值600使用新分光光度計時每種細胞類型的板計數(shù)值。
DS-11 微量模式可實現(xiàn)更高的 OD600值使用其獲得特別的自動路徑長度調整。請記住，微量和比色皿模式使用不同的光學配置，因此在比較使用兩種模式測量的值時，建立轉換因子可能很有用。
最好使用接近所需目標 OD 的測量值來確定因子600價值。酌情考慮稀釋。
可以確定一個等效因子，然后將其應用于使用不同分光光度計進行的測量。
下面的數(shù)據(jù)是一個例子，說明了在不同分光光度計上測量相同的光散射樣品如何導致不同的 OD600 測量值（表 1 和表 2）。
將 Formazin 4000NTU 濁度標準品 （Hach cat #246149） 稀釋 7.7 倍以產生初始儲備液。然后在水中進行一系列 2 倍連續(xù)稀釋。使用一次性比色皿和 2 mL 的相應稀釋度測量每種溶液，一式三份。未對 600 nm 測量值進行基線校正。
Table 1: Mean OD600 Values; n=3
| Sample | Agilent 8453 | DS-11+ |
|---|---|---|
| Stock | 1.1588 | 0.8376 |
| Stock 1:2 | 0.5696 | 0.4245 |
| Stock 1:4 | 0.2794 | 0.2173 |
| Stock 1:8 | 0.1372 | 0.1125 |
| Stock 1:16 | 0.0684 | 0.0594 |
| Stock 1:32 | 0.0326 | 0.0310 |
| Stock 1:64 | 0.0140 | 0.0158 |
Table 2: Precision of Replicate Measurements; n=3
| Sample | Agilent 8453 % CV | DS-11+ % CV |
|---|---|---|
| Stock | 0.61% | 0.24% |
| Stock 1:2 | 0.82% | 1.15% |
| Stock 1:4 | 1.61% | 2.76% |
| Stock 1:8 | 0.63% | 1.92% |
| Stock 1:16 | 0.91% | 3.82% |
| Stock 1:32 | 5.03% | 8.58% |
| Stock 1:64 | 11.17% | 10.82% |
線性范圍
基于比色皿的儀器通常具有測得光程的外徑上限約為 1.5。外徑600如此高的值可能不足以覆蓋培養(yǎng)物的整個生長周期，并且在生長方面可能不是線性的。死亡期的培養(yǎng)物可能表現(xiàn)出不同的光散射行為，這可能會影響活細胞密度與測得的 OD 之間的相關性600值。
因此，必須仔細稀釋培養(yǎng)物，以便繪制整個生長曲線或確定測量值不再與活細胞密度線性相關的極限。
此外，盡管測得的 OD600值和特定像元密度在兩種不同儀器上的范圍可能重疊，線性線的斜率可能不同。表 1 中的數(shù)據(jù)如下圖所示（圖 1）作為此范式的一個例子。
當使用轉換因子將數(shù)據(jù)從一臺儀器關聯(lián)到另一臺儀器時，可能需要對特定的 OD 范圍使用不同的因子來補償不同的斜率。
注意：盡管斜率不同，但兩種儀器的 R2 值均> 0.9999。
The OD600應用程序允許用戶輸入一個細胞數(shù)因子，該因子將乘以測得的 OD600值來計算近似的細胞/mL 濃度。如前所述，OD600值取決于被采樣溶液中細胞的大小和形狀以及細胞密度。一個 OD600值 1 可能等于大約 1 x108一種細胞類型的細胞，但僅等于 0.5 x108細胞。
要使用此功能，建議最初為每種細胞類型確定適當?shù)募毎麛?shù)轉換因子。構建 OD 的校準曲線600值與瓊脂平板上生長的菌落形成單位的細胞數(shù)量相關。確保在適當時乘以稀釋因子。
酵母細胞通常比細菌細胞大。因此，OD600值 1 通常相當于酵母細胞比細菌細胞少。
為確保最佳結果，以 OD 為目標600對于微量和比色皿模式，應根據(jù)經驗確定每種細胞類型的值。
比色皿模式（推薦）
微量模式
Formula Methods 應用程序支持創(chuàng)建自定義方法和公式，包括用于測量 600 nm 以外波長下 OD 的方法和公式。例如，可以使用以下參數(shù)測量 650 nm 處的 OD：分析 nm = 650，基線 nm = 留空，最小 nm = 550，最大 nm = 700。
DeNovix DS-11 系列儀器能夠使用預配置的 OD 測量酵母和微生物培養(yǎng)物600應用程序。
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