8.固相肽合成的一個(gè)例子
以下是使用堿不穩(wěn)定的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保護(hù)基團(tuán)在聚酰胺或聚苯乙烯樹脂上合成肽的合成步驟的概述。使用下面概述的技術(shù)，將獲得在N-末端用乙酰基封端，在C-末端用伯酰胺(CONH2)封端的肽。
為手動(dòng)肽合成設(shè)置玻璃器皿
手動(dòng)肽合成可以在具有三通閥的燒結(jié)過濾器反應(yīng)容器中完成，該三通閥通過1孔塞子安裝在1 L側(cè)臂真空燒瓶上。一個(gè)閥門用于充入氮?dú)?，氮?dú)馐紫韧ㄟ^一個(gè)小的Drierite柱，然后進(jìn)入反應(yīng)混合物以攪拌溶液和混合試劑。另一個(gè)閥門用于排空過量的反應(yīng)溶液，并使用真空瓶洗滌溶劑。用于固相合成的所有玻璃片應(yīng)在使用前用硅烷化試劑(如DCM中的1-5%二甲基二氯硅烷)處理，以避免靜電荷的積累，靜電荷的積累會(huì)使樹脂很難處理。
聚酰胺樹脂的制備
聚酰胺(PL-DMA)樹脂(1g)用乙二胺(40 ml)在50 ml Falcon管中在搖床上處理過夜，然后過濾，用5×10ml 1:1二甲基甲酰胺(DMF):二氯甲烷(DCM)溶液、5×10ml 1:1 DCM洗滌，并使用苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷六氟磷酸鹽(PyBOP) (3 eq)、1-羥基苯并三唑水合物(HOBt) (3 eq)和二異丙基乙胺(DIPEA)裝載Fmoc-Rink然后可以在真空下干燥，并儲(chǔ)存在-15攝氏度，直到需要。
在合成前和合成過程中處理樹脂
樹脂首先在10毫升1∶1 DCM∶DMF中溶脹15分鐘，然后瀝干。每次完成氨基酸偶聯(lián)后，還用5×10ml 1:1 DCM和DMF洗滌樹脂。
Fmoc-去保護(hù)
每次氨基酸偶聯(lián)后，用2×10ml 20%哌啶的DMF溶液進(jìn)行Fmoc去保護(hù)，每次處理用N2攪拌10分鐘。然后用5×10毫升DMF洗滌樹脂，接著用5×10毫升1:1 DCM:DMF洗滌。
添加氨基酸
為了在Fmoc-聚酰胺-Rink樹脂上開始肽合成，通過用哌啶處理樹脂來除去Fmoc基團(tuán)。然后使用在1∶1 DCM∶DMF中的PyBOP (3 eq)、HOBt (3 eq)和DIPEA (6 eq)將第一個(gè)氨基酸偶聯(lián)至樹脂的Fmoc-去保護(hù)的N-末端胺，或之前偶聯(lián)的氨基酸，直到樹脂對(duì)茚三酮呈陰性。
監(jiān)測(cè)氨基酸偶聯(lián)的進(jìn)展
氨基酸偶聯(lián)的過程可以用茚三酮或?qū)β弱珌砀櫋＼崛芤涸谟坞x伯胺的存在下變成深藍(lán)色(陽性結(jié)果)，但在其他情況下是無色的(陰性結(jié)果)。如果使用乙醛作為溶劑，在伯胺的存在下，或者如果使用丙酮，在仲胺的存在下，對(duì)-氯醌溶液將使樹脂珠變成深黑色或藍(lán)色；否則珠子保持無色或淡黃色。(測(cè)試概述如下)
茚三酮測(cè)試(1)
向微量離心管中加入2滴40%苯酚的乙醇溶液、2滴0.014 M KCN的吡啶溶液和4滴5%茚三酮的乙醇溶液，以及抹刀一端大小的樹脂樣品，然后渦旋混合物，并在100°c下加熱5分鐘
用氯醌測(cè)試(2)
向微量離心管中加入5滴丙酮或乙醛、5滴對(duì)氯醌的甲苯飽和溶液，以及小刮刀一端大小的樹脂樣品，然后渦旋混合物，并在室溫下靜置5分鐘。丙酮用于檢測(cè)仲胺，乙醛用于檢測(cè)伯胺。
持續(xù)肽延伸
一旦氨基酸的偶聯(lián)完成，就洗滌樹脂，用哌啶去保護(hù)Fmoc基團(tuán)，并再次洗滌樹脂，為下一次偶聯(lián)做準(zhǔn)備。重復(fù)這一過程，直到添加完所有必需的氨基酸。
乙?；疦-末端
肽序列完成后，可以用2ml 1:1乙酸酐和三乙胺在10ml 1:1 DCM:DMF中乙酰化N-末端胺1小時(shí)或直到茚三酮陰性，然后用5×10ml 1:1 DCM:DMF洗滌樹脂，然后將肽從樹脂上切下。如果需要，N-末端也可以作為游離胺留下。
從樹脂上切割肽
用3×10ml 96∶2∶2的TFA、三異丙基硅烷(TIPS)和水(H2O)處理樹脂，每次處理10分鐘，然后過濾掉樹脂，將合并的濾液靜置1小時(shí)，以確保除去酸不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)。
從樹脂上切割后肽的處理
將TFA在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)至干(或重油或玻璃，如果它不凝固的話)，隨后向燒瓶中加入5 ml*醚以沉淀肽，并除去大部分副產(chǎn)物。將肽和乙*的懸浮混合物加入到50 ml Falcon管中，并以3000 rpm的速度旋轉(zhuǎn)10-20分鐘(IEC離心機(jī)),直到可以倒出乙*而不損失任何肽。加入更多的后，通過渦旋使肽重新懸浮。再次離心混合物，倒出，洗滌過程重復(fù)兩次以上。最后，產(chǎn)品可以在脫粘器中的Falcon管中風(fēng)干過夜。
通常使用制備型HPLC來純化最終產(chǎn)物。獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)以確保獲得目標(biāo)肽。
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